蛋白質(zhì)的功能研究涉及了許多方法，不過(guò)這類(lèi)研究的第一步往往是表達目標蛋白。日前，《BioTechniques》雜志的編輯們挑選了今年最受歡迎的五篇蛋白質(zhì)分析文章，其中有三篇提出了改善蛋白質(zhì)表達的實(shí)用方法。

1. Lyophilized Escherichia coli-based cell-free systems for robust, high-density, long-term storage

無(wú)細胞蛋白質(zhì)合成(CFPS)系統，是快速獲得大量目標蛋白的一種簡(jiǎn)單途徑。與體內蛋白表達系統相比，CFPS更適合于高通量應用。CFPS系統通常是細胞抽提物的水溶液，一般通過(guò)冷凍儲存，而這會(huì )占據大量的冷藏空間。凍干CFPS系統能夠顯著(zhù)減少體積，解決它的冷藏問(wèn)題。Bradley Bundy團隊今年四月發(fā)表文章，詳細描述了凍干CFPS系統的各個(gè)步驟。這篇文章提出了一個(gè)簡(jiǎn)單直觀(guān)的方案，用于凍干源自E. coli細胞提取物的CFPS系統。文章指出，凍干CFPS系統不僅能大大減少冷藏空間，而且凍干的提取物在室溫下更加穩定，運輸起來(lái)更為簡(jiǎn)單。研究者們只需要給凍干粉加入水就可以獲得蛋白合成系統。

2. A technique to increase protein yield in a rabbit reticulocyte lysate translation system

在表達哺乳動(dòng)物蛋白的時(shí)候，人們往往更傾向于使用哺乳動(dòng)物無(wú)細胞系統，比如兔網(wǎng)織紅細胞裂解物(RRL)。這些系統能夠生成翻譯后修飾，而這種修飾是蛋白正常功能所必需的。不過(guò)RRL的主要問(wèn)題在于，這個(gè)系統的蛋白產(chǎn)量比較低。添加提高翻譯產(chǎn)量的蛋白因子，是解決這個(gè)問(wèn)題的一種途徑。

病毒在感染過(guò)程中會(huì )用蛋白因子上調宿主細胞的翻譯活性。Denis Kainov等人發(fā)現，這種因子很適合用來(lái)提高RRL的產(chǎn)量。他們選用了甲型流感病毒的NS1蛋白，這種蛋白能阻止宿主的翻譯機器關(guān)閉。研究人員將腦心肌炎病毒(EMCV)的內部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)添加到目標mRNA上，然后向RRL系統中加入重組NS1，結果使蛋白產(chǎn)量提高了十倍。如此顯著(zhù)的改善受到了RRL使用者們的一致歡迎。

3. Off-on polyadenylation strategy as a supplemental mechanism for silencing toxic transgeneexpression during lentiviral vector production

這篇文章描述了一個(gè)在哺乳動(dòng)物細胞中有效抑制轉基因表達的方法。表達毒性轉基因的慢病毒載體可以用于基因治療，雖然起治療作用的轉基因需要在目標細胞中表達，但在載體生產(chǎn)過(guò)程中抑制轉基因表達是很有必要的。293T細胞是常用的慢病毒載體生產(chǎn)細胞，轉基因的表達會(huì )顯著(zhù)降低293T細胞的產(chǎn)量，因此必須被盡可能的沉默。

常用方法是使用組織特異性啟動(dòng)子，這種啟動(dòng)子只在目標細胞有活性，在載體生產(chǎn)細胞中沒(méi)有活性。然而，這種方法并不總是那么有效。Bagnis等人為我們提供了另一種選擇，他們六月份發(fā)表的文章描述了一個(gè)新慢病毒載體，能夠在生產(chǎn)載體的293T細胞中強力沉默轉基因。研究人員精心布置了病毒控制元件的定位和方向，并構建了缺乏多聚腺苷酸化信號的轉基因，以便達到強效沉默的效果。這種載體轉染目標細胞之后，逆轉錄會(huì )使病毒控制元件重排，轉基因只需要一個(gè)多聚腺苷酸化信號就可以表達。這一技術(shù)將成為在慢病毒載體生產(chǎn)細胞中抑制毒性轉基因表達的有力工具。

4. Resolving acetylated and phosphorylated proteins by neutral urea Triton-polyacrylamide gel electrophoresis: NUT-PAGE

理解磷酸化、乙?；确g后修飾在蛋白功能調控中起到的作用，是研究真核蛋白的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。這些修飾會(huì )改變蛋白所帶的電荷，可以通過(guò)等電聚焦(IEF)等電荷依賴(lài)性凝膠電泳進(jìn)行分析。然而，在許多情況下IEF需要SDS-PAGE的補充，以分辨電荷類(lèi)似但質(zhì)量不同的蛋白，這無(wú)疑增加了實(shí)驗的繁瑣性也提高了實(shí)驗成本。TAU(Triton acetic acid urea) PAGE是一種基于尿素的凝膠電泳，能夠使蛋白變性并維持蛋白所帶的電荷，這樣的方法可以同時(shí)依據質(zhì)量和電荷將蛋白分離。這個(gè)方法的問(wèn)題在于，TAU-PAGE的酸性不能很好的分析一些磷酸化蛋白。Buehl等人八月份發(fā)表的文章，描述了一種中性pH的尿素凝膠系統。他們開(kāi)發(fā)的NUT(neutral urea Triton)-PAGE很簡(jiǎn)單也很便宜，可以很好的分析酸性和堿性蛋白的磷酸化和乙?；问?。NUT-PAGE有望成為IEF、2-D PAGE之外的另一種選擇。

5. Investigation of membrane protein–protein interactions using correlative FRET-PLA

研究蛋白質(zhì)功能很多時(shí)候意味著(zhù)要了解它們與其他蛋白的互作。分裂泛素系統(split ubiquitin system)等體外分析法可以初步鑒定膜蛋白之間的互作。不過(guò)免疫共沉淀這樣的標準方法并不適合對膜蛋白互作進(jìn)行驗證，因為膜蛋白離開(kāi)細胞膜之后一般不能正?；プ?。

膜蛋白互作最好是在體內實(shí)驗中進(jìn)行研究，讓這些蛋白始終處于細胞膜中?？蛇x擇的分析方法主要有FRET(熒光共振能量轉移)和PLA(鄰位連接)。Ivanusic等人十月份發(fā)表的文章，向人們展示了這兩種方法結合而成的FRET-PLA技術(shù)。他們將兩個(gè)interactor分別融合在黃色熒光蛋白(YFP)和青色熒光蛋白(CFP)上，然后給蛋白標記上不同的多肽，作為PLA時(shí)抗體結合的目標。這一技術(shù)大大提高了定位膜蛋白互作的靈敏度和空間分辨率，能夠分辨納米級的鄰近程度。