1. 引言

同種異體造血干細胞移植（allo-HCT）是免疫治療中一種有效方法，通過(guò)天然免疫系統和獲得性免疫系統協(xié)同產(chǎn)生抗腫瘤作用。通過(guò)識別腫瘤相關(guān)抗原（TAAs）或次要組織相容性抗原（mHags），供體淋巴細胞輸注（DLI）給移植后白血病復發(fā)的患者可介導抗腫瘤作用。

然而，由于大多數TAA自身蛋白表達異常，以致T細胞表達低親和力T細胞受體（TCR），排斥反應可能比移植物抗腫瘤效應（GVT）更強。雖然用于治療慢性粒細胞性白血病效果很好，而急性白血病異體淋巴細胞輸注療效有限，其2年生存率不到20%。

此外，并發(fā)癥移植物抗宿主?。℅VHD）造成病人死亡或生活質(zhì)量下降占顯著(zhù)比例，有報道顯示接受匹配供體的造血干細胞移植的患者GVHD發(fā)生率高于50%。雖然有報道稱(chēng)產(chǎn)生植物抗腫瘤效應（GVT）而沒(méi)有發(fā)生移植物抗宿主?。℅VHD）的情況，本文編譯作者愛(ài)康得Paul認為兩種機制的重疊，次要組織相容性抗原（mHags）介導了移植物抗腫瘤效應（GVT）和移植物抗宿主?。℅VHD），可同時(shí)作用于造血和非造血組織。

臨床試驗中將次要組織相容性抗原（mHags）特異性T細胞擴增并過(guò)繼輸注到移植后疾病復發(fā)的患者身上，部分患者可獲得暫時(shí)性完全緩解（CR），然而此方案因果規律復雜，并且T細胞在體外擴增長(cháng)達12周。長(cháng)期的培養可導致T細胞衰竭，這可能是其在患者體內持續性有限的一個(gè)潛在原因。

另一個(gè)方法是利用轉基因TCR或嵌合抗原受體（CAR）基因修飾的T細胞。然而TCR轉導的T細胞受HLA限制，TCR和內源性TCR錯配可導致親和力降低或表達不期望的特異性。而CAR可作為免疫治療的通用平臺，因為它不受HLA限制。在T細胞單鏈殺傷裝置上負載特異性抗體，這種錯配的風(fēng)險很低。另外，HLA識別抗原的獨立機制，可以防止CAR-T細胞在抗原的處理加工中出現免疫逃避機制。

通常CAR-T只在正常細胞與腫瘤細胞間非多態(tài)地識別表面分子，以提高對其安全的正當關(guān)切。事實(shí)上，輸注CAR-T細胞使難治性白血病得到完全緩解的同時(shí)，也會(huì )伴有細胞因子釋放綜合征，在靶向腫瘤相關(guān)抗原（TAAs）的實(shí)體瘤時(shí)甚至可出現致命的非腫瘤靶向毒性。這些問(wèn)題促使美國國立衛生研究院重組DNA咨詢(xún)委員會(huì )提供了一些臨床建議，包括實(shí)施小劑量遞增方案，共表達自殺基因來(lái)阻斷不可控毒性的或控制遠期毒性。

在這篇綜述中，我們將討論基因修飾的自體或異體T細胞，用于癌癥免疫治療的安全性的當前理念和應對措施。（相關(guān)會(huì )議推薦：下一代CAR與免疫細胞治療研討會(huì )即將于11.7在上海舉行?。?

2. CAR-T細胞的設計

鑒于第一代CARs（圖1A）有限的擴增和持久性，研究者在病毒特異性T細胞表面導入CAR，為了可以讓抗原遞呈細胞交叉遞呈的抗原產(chǎn)生共刺激。11位患有進(jìn)展期神經(jīng)母細胞瘤的兒童給予disialoganglioside GD2第一代CAR修飾的EB病毒特異性CTL細胞?；蛐揎椀募毎趲缀跻话氲牟±w內持續了數周的轉運與介導的客觀(guān)反應，11患者中3/4獲得完全緩解。

圖1：CAR的結構和降低毒性的雙靶向臨床前策略。（A）CAR的胞外結構包括先導序列，單鏈可變區(scFv)(H (重) 和L (輕) 鏈)，通過(guò)接頭（如SG，GS）連接。間隔區（如人免疫球蛋白D分子鉸鏈區）具有柔韌性并連接跨膜區（TM）?？缒^包括例如人免疫球蛋白G的恒定區，胞內結構域包括CD3ζ內切域（第一代的CARs），加上CD28域（第二代），或再加一個(gè)額外的共刺激域（第三代CARs）。（B）用雙靶向來(lái)減少毒性反應：(i)反式信號傳導CAR將共刺激域和殺傷域分別靶向2種不同的腫瘤抗原，當只有1個(gè)抗原結合時(shí)限制CAR的激活，(ii)抑制性CAR是用抑制性信號域取代ζ鏈，抑制了共表達活化CAR的激活信號，(iii)串聯(lián)型CAR是由單結構靶向2個(gè)不同抗原的2個(gè)抗原結合片段組成的，當它們同時(shí)結合可產(chǎn)生協(xié)同效應。CAR-1和CAR-2作為示例，分別識別抗原-1和抗原-2.

為進(jìn)一步提高CAR-T的擴增能力和持續性，研究人員在ζ鏈中加入了一種或多種共刺激信號域，這便分別出現了第二代和第三代CARs，主要提高CAR修飾的T細胞擴增能力和避免T細胞誘導激活的細胞凋亡（圖1A）。確實(shí)，臨床前模型證明這一嘗試是成功的，后來(lái)的臨床試驗也證實(shí)了在CD19惡性淋巴瘤患者中使用的二代CD19 CAR-T細胞，其擴增能力和持久性高于第一代CD19 CAR-T細胞。

來(lái)自許多機構的臨床試驗報道了靶向復發(fā)性難治性急性淋巴細胞白血?。ˋLL）的驚人療效?？偟膩?lái)說(shuō)，已報道的CD19 CAR-T細胞控制并緩解了患者的復發(fā)性難治性急性淋巴細胞白血?。ˋLL）。大多數試驗包括化療清髓都是努力為了給T細胞擴增創(chuàng )造一個(gè)有利的內環(huán)境。Davila等人報道在輸注CD28共刺激域的CAR-T細胞，50%成人白血病患者獲得了造血干細胞移植的效果，在最后一次隨訪(fǎng)時(shí)仍在持續緩解。Maude報告了30名兒童和成人患者接受了4-1BB共刺激域的CD19 CAR-T細胞治療，其中27例患者(90%)獲得完全緩解（CR），包含2名blinatumomab難治性和15名接受過(guò)造血干細胞移植的患者。CAR-T細胞在患者體內應答擴增可通過(guò)血液，骨髓和腦脊液檢測到。6個(gè)月的無(wú)進(jìn)展生存率為67%，總生存率為78%。研究者證實(shí)在此項試驗中，患者即使不進(jìn)行同種異體造血干細胞移植，CAR治療可能會(huì )讓患者持續緩解長(cháng)達2年以上。

Lee等人，以學(xué)齡兒童和年輕人為主的復發(fā)性難治性急性淋巴細胞白血?。ˋLL），通過(guò)CD28共刺激域的自體CD19 CAR-T治療，70%B型急性淋巴細胞白血?。˙-ALL）患者和60%MRD陰性的患者獲得完全緩解。12名治療后MRD陰性患者中有10名接受了異體造血干細胞移植，在中位隨訪(fǎng)中保持無(wú)疾病狀態(tài)10個(gè)月。

已有報道CD19 CAR治療難治性慢性淋巴細胞白血?。–LL）患者的成功案例，而更大規模的CD19-CAR研究需要在非霍奇金淋巴瘤上進(jìn)行，非霍奇金淋巴瘤的CD20 CAR-T細胞治療初步獲得了一些可喜的成績(jì)。本文編譯作者愛(ài)康得Paul認為CAR-T治療實(shí)體瘤的最佳療效可能需要一些額外的修飾。盡管晚期實(shí)體瘤患者接受抗間皮素mRNA電轉導的T細胞治療(RNA-CAR-T-meso cells)出現腫瘤消退的證據，而神經(jīng)母細胞瘤患者使用GD2靶向的CAR-T細胞治療可見(jiàn)疾病的完全緩解。通過(guò)他優(yōu)秀的綜述可知，CAR的靶向抗原種類(lèi)在迅速增加。

提高體外擴增的基因修飾的T細胞療效的維持，自我更新，侵潤以及歸巢能力正在積極的研究中。值得注意的是，在大部分研究中，T細胞激活用CD3/CD28小體而不是可溶的CD3-抗體，這可能有助于提高體內的療效。

在臨床試驗中需要評估，幼稚細胞還是中央記憶細胞誘導的效應T細胞，能有更強的擴增能力、持久性和抗腫瘤活性。意大利研究小組報道，在低濃度(IL)-7和IL-15中，用CD3和CD28抗體偶聯(lián)小體激活的幼稚T細胞能促進(jìn)T記憶干細胞（TSCM）的持續和擴增，分別連續植入小鼠中，提示有自我跟新的能力。

3.自體CAR T-Cells輸注的副作用

在臨床試驗中CAR-T細胞產(chǎn)生非腫瘤靶向作用和細胞因子釋放綜合征（CRS），以及在急性髓性白血?。ˋML）的臨床前模型中有明顯的骨髓抑制。

嚴重不良事件（SAEs）可能與一些因素相關(guān)，包括輸注細胞的劑量，受治者體內的殘留病灶以及靶抗原在正常組織中的表達量。

由于腫瘤相關(guān)性抗原也會(huì )在正常組織中表達，為了盡量降低基因重組T細胞的毒性風(fēng)險，首先應選取腫瘤細胞特異性表達的抗原。然而這樣的抗原通常不易獲得，當靶向目標抗原時(shí)，進(jìn)行體外和（或）體內試驗來(lái)嘗試預測毒性的風(fēng)險。體外細胞毒性試驗充滿(mǎn)挑戰，TAA重定向的T細胞與表達目的抗原的靶向腫瘤細胞，包括來(lái)源于正常組織的細胞，可能不會(huì )重現體內模型的三維立體復雜結構。

體內動(dòng)物模型包括注射人基因轉導的T細胞，表達人抗原的人源化抗原轉基因小鼠模型，或在小鼠T細胞上導入CAR分子靶向鼠源相關(guān)抗原的小鼠模型。盡管已在動(dòng)物模型中對細胞因子釋放綜合征（CRS）和B細胞再生障礙進(jìn)行了研究，但存在的一些局限性可能限制這些現象在人類(lèi)中重現，人和動(dòng)物的生物等效性和生物分布之間的關(guān)聯(lián)存在不同，以及有不同抗原的表達，共刺激分子的表達和（或）細胞因子環(huán)境。非靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物模型也被用來(lái)評價(jià)基因修飾的T細胞對正常組織的毒性，其優(yōu)點(diǎn)是它與人蛋白序列同源性程度較好。

正如之前所述，為盡力提高細胞在體內擴增和抗腫瘤活性，第二、三代CAR被開(kāi)發(fā)出來(lái)。然而可以預料的是由于T細胞被高度活化和（或）協(xié)同刺激，輸注第二、三代CAR-T細胞會(huì )導致毒性風(fēng)險的增加。事實(shí)上，輸注第二代CAR-T細胞會(huì )造成較高的嚴重細胞因子釋放綜合征（sCRS）發(fā)生率。在治療實(shí)體瘤中，由于肺上皮細胞表達低水平的HER-2，以及包含CD28和4-1BB共刺激分子的高效CAR，靶向HER-2抗原的第三代CAR-T細胞可引發(fā)致命的肺毒性。

CD19 CAR-T細胞研究中，B細胞再生障礙和細胞因子釋放綜合征（CRS）常被報道。一些患者會(huì )發(fā)生令人擔憂(yōu)的但可逆的神經(jīng)系統癥狀，如譫妄和癲癇發(fā)作，后者更像是全身T細胞介導的炎癥反應，而不是CAR-T細胞直接導致的腦毒性。CAR-T細胞應用于髓性白血病已在小鼠模型中測試，進(jìn)一步的臨床開(kāi)發(fā)被嚴重的骨髓抑制所阻礙，因此必須找出克服這種嚴重不良反應的方法，例如備用正常的造血干細胞和成熟的造血祖細胞。

另一個(gè)潛在的嚴重不良反應是利用植入熱點(diǎn)的整合型載體修飾的細胞，可能導致致癌基因失去調控而癌變。雖然在時(shí)刻監控著(zhù)輸注的轉導干細胞，但是在臨床研究中，使用轉基因T細胞導致這種嚴重的不良反應至今未有報道。

4. 美國國立衛生研究院重組DNA咨詢(xún)委員會(huì )的建議

這些建議為進(jìn)行CAR-T臨床研究的科學(xué)家提供指導。這些建議對第一代CAR-T細胞的臨床試驗（不含EB病毒特異性細胞毒性T細胞）和第二、三代CAR-T細胞的臨床試驗進(jìn)行了區分，在給藥指導中，對細胞因子或預處理以及輸注的劑量時(shí)間提供建議。對于第一代CAR-T細胞，第一代CAR負載的EBV T細胞，第二、三代CAR-T細胞，建議臨床初始劑量分別為3?106/kg，3?106/kg，3?105/kg。當靶向新抗原時(shí)，則建議將上述劑量分別降至3?104/kg，1?104/kg和1?104/kg。需要注意的是這些建議劑量基于未篩選的CAR-T細胞，而最終之前的亞型篩選可能對毒性有影響。

對于細胞因子的使用，它有助于第一代CAR-T細胞的擴增，對第二、三代CAR-T細胞的潛在幫助仍需進(jìn)一步的探討。而進(jìn)行化療預處理則被視為對輸注的第二、三代CAR-T細胞的存活與持續有潛在的幫助。

此外為降低輸注細胞的毒性風(fēng)險，對第二、三代CAR-T細胞輸注劑量進(jìn)行拆解是必要的，比如第一天輸注30%第二天輸注70%（在充分的安全評估后），或者通過(guò)3天分別輸注10%，30%，60%。

最后，建議使用自殺基因來(lái)阻斷未知的或不可控的遠期毒性，盡管是否能控制住臨床明顯的嚴重不良反應還未可知。

5. 細胞因子釋放綜合征的治療

細胞因子釋放綜合征（CRS）就像炎癥反應一樣，臨床表現為發(fā)燒，惡心，頭痛，心動(dòng)過(guò)速，低血壓，缺氧，以及心臟或神經(jīng)系統癥狀。診斷標準包括：(i)發(fā)熱至少持續3天，(ii)兩種細胞因子濃度最高值至少升高75倍或一種細胞因子濃度最高值至少升高250倍，(iii)至少出現一種毒性臨床癥狀如低血壓（至少一項靜脈血管壓力），或缺氧（血氧濃度< 90%），或神經(jīng)系統癥狀（包括神志改變，遲鈍和癲癇發(fā)作）。

然而有些副反應，比如靶向B細胞相關(guān)抗原的CAR-T細胞引起的B細胞再生障礙，可通過(guò)補充丙種球蛋白來(lái)輕松處置；異基因造血干細胞移植的長(cháng)期護理（入選患者護理標準）。細胞因子釋放綜合征（CRS）沒(méi)有標準治療方式，目前用類(lèi)固醇進(jìn)行處置，或最近使用的IL-6單克隆抗體tocilizumab來(lái)處置。

最近提出了一項嚴重細胞因子釋放綜合征的處置方案。該方案特別警告說(shuō)，攜有較大殘留病灶負荷的患者接受CAR-T治療產(chǎn)生嚴重細胞因子釋放綜合征的風(fēng)險更高，有可能借助IL-6在吞噬腫瘤碎片后產(chǎn)生單核細胞/巨噬細胞（巨噬細胞活化綜合征，MAS）。此外，只會(huì )在嚴重細胞因子釋放綜合征中觀(guān)測到C反應蛋白（CRP）≥20 mg/dL，這項被列入了診斷嚴重細胞因子釋放綜合征依據，以替代用細胞因子升高水平為依據的診斷。

所提出的方案列舉了以下4項示例：（1）如果患者將發(fā)熱至少持續2天，提前給予左乙拉西坦（2）一旦CRP水平≥20 mg/dL建議轉入ICU特別護理（3）出現毒性臨床癥狀，該方案建議應考慮使用tocilizumab處置（4）如果在tocilizumab第二次給藥后患者的毒性癥狀仍沒(méi)緩解，使用類(lèi)固醇是必要的，如每日兩次靜脈注射10mg地塞米松。雖然這些指南仍在驗證，他們意味著(zhù)是一個(gè)有效的辦法，為系統處置患者的細胞因子釋放綜合征提供了指導。然而，因為tocilizumab和糖皮質(zhì)激素可終止輸注的T細胞的抗腫瘤作用，專(zhuān)門(mén)去除同種異體活性T細胞（和/或緩解炎性反應而不完全殺滅輸注的細胞）的針對性策略需要研究和（或）實(shí)施。

6. 保障安全的對策

發(fā)生嚴重不良反應總出現在CAR-T細胞輸注后，這就期望能有緩解和（或）消除毒性的對策。由于大部分毒性，與輸注的T細胞大量擴增相關(guān)，且無(wú)法用藥物來(lái)停止不期望的擴增以緩解不良反應，引入自殺基因或開(kāi)發(fā)只針對腫瘤進(jìn)行殺傷的重組T細胞，為扭轉不利局面帶來(lái)希望。

6.1自殺基因的應用

自殺基因可以選擇性清除過(guò)繼輸注的細胞。細胞治療制品的自殺基因除了可以選擇性清除基因修飾的細胞，還會(huì )避免鄰近的細胞和（或）組織受到傷害。

根據作用原理自殺基因技術(shù)大致分為三類(lèi)：代謝，二聚化結構誘導和治療性單克隆抗體介導的安全開(kāi)關(guān)。表1給出了迄今為止研究最多的自殺基因的概覽。

自殺基因理想的活化劑應具備生物惰性，有高度的生物利用度和生物分布，并且本身低毒性或不具有毒性。

任一特定情況都應具體設計自殺基因的方案，同時(shí)應兼顧靶細胞的性質(zhì)，自殺基因的來(lái)源，活化劑的類(lèi)型，啟動(dòng)的時(shí)機和目標群體的消除動(dòng)力學(xué)。

代謝型自殺基因是基于無(wú)毒性藥物在基因修飾的細胞內轉化為具有細胞毒性的化合物。例如磷酸化的核苷類(lèi)似物人單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）與甘昔洛韋（GCV）相互作用，其產(chǎn)物以三磷酸形式進(jìn)入DNA作用于DNA聚合酶，導致鏈終止反應引發(fā)細胞凋亡。HSV-TK / GCV也可通過(guò)CD95/CD95-L途徑，使Fas死亡結構域相關(guān)蛋白（FADD）和caspase-8形成死亡誘導信號復合體誘導細胞凋亡。

凋亡基因（如：半胱天冬酶）通過(guò)誘導凋亡來(lái)清除細胞。iCasp9自殺基因包含FKBP12-F36V結構域，可通過(guò)柔性Ser-Gly-Gly-Gly-Ser連接半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9，后者不含募集結構域。FKBP12-F36V 包含一個(gè)FKBP結構域，在第36個(gè)氨基酸殘基位點(diǎn)上苯丙氨酸替代了纈氨酸。它具有高選擇性和亞納摩爾親和力，能夠結合二聚合成配基，如其他惰性小分子AP1903。轉基因盒子也包含平末端CD19（ΔCD19）分子，后者作為選擇性標記以保證純度≧90%。

自殺基因的安全性和有效性已經(jīng)在單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）或iCasp9自殺基因修飾供的體淋巴細胞輸注的臨床試驗中得到證實(shí)，它能消除急性和慢性抗移植物宿主病。

單純皰疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）自殺基因修飾的供體淋巴細胞輸注（DLI）也可產(chǎn)生移植物抗腫瘤作用，甚至在患者體內產(chǎn)生抗HSV-TK抗體。有解釋稱(chēng)可能HSV-TK的逐步消除促成了長(cháng)期的移植物抗腫瘤效應。其他間接證據顯示在一個(gè)疾病復發(fā)的病人身上發(fā)現了移植物抗腫瘤作用，HLA不匹配的白血病母細胞開(kāi)始減少。iCasp9 修飾的供體淋巴細胞輸注（DLI）產(chǎn)生的移植物抗腫瘤作用還需更大規模的研究和長(cháng)期隨訪(fǎng)。

有趣的是，在自殺基因修飾的供體淋巴細胞輸注（DLI）的臨床試驗中，觀(guān)測到殘余的非同種異體T細胞長(cháng)期持續存在。有一種可能的原因是，憑借少量的病毒和真菌活性T細胞有較高的轉基因表達，優(yōu)先清除的細胞在移植物抗宿主病期間積極擴增。盡管這體現了供體淋巴細胞輸注（DLI）使用的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，但對于減緩嚴重不良反應，徹底清除CAR/TCR-T細胞或造血干細胞可能是必要的。因此，確保輸注的大部分細胞（＞99%）表達自殺基因很重要，例如通過(guò)細胞分選以確?？勺畲蠡那宄毎?。

表達iCasp9的CD19/CD20 CAR-T細胞在臨床前試驗中證明是可行的，共表達iCasp9基因和抗disialoganglioside GD2分子的CAR-T細胞，治療肉瘤或神經(jīng)母細胞瘤的I期臨床實(shí)驗正在進(jìn)行(Clinicaltrials.gov 識別碼分別為 NCT01822652 和NCT01953900)。如果毒性只與轉導的細胞有關(guān)，用特異性標記可以清除，尤其是在自體細胞治療時(shí)，但前提是被轉導的細胞表達自殺基因，那么在發(fā)生嚴重不良反應時(shí)就可以被清除。

使CAR-T表達自殺基因的辦法很多。細胞可用CAR構建之前自殺基因克隆的雙表達載體轉導，以確保所有表達CAR的細胞同時(shí)表達自殺基因。另外引入特定標記來(lái)分選和收集表達自殺基因的細胞，在使用異體CAR-T細胞治療時(shí)強烈推薦使用這種方法?；蚋脑熨|(zhì)膜蛋白表達的細胞，可以用特定單抗來(lái)選擇，跟蹤，去除體內的這類(lèi)細胞。比如用逆轉錄病毒將CD20導入T細胞，輸入T細胞后可用CD20單抗來(lái)處置，這種自殺基因策略已在臨床前模型中得到驗證。依據這個(gè)概念，其他可用的臨床前模型也被研究，Kieback等人進(jìn)行了一項有趣的試驗，在臨床前模型中，由10個(gè)氨基酸標記的c-myc蛋白插入TCR序列，在給予特定的單抗后，這些被修飾的細胞可以被選擇，跟蹤和清除，并且這個(gè)方法可以用在CAR結構中。此外，倫敦的研究中制備了一個(gè)簡(jiǎn)潔的自殺基因(RQR8)，抗原表位結合CD34使CD20表達CD34的選擇性，在給予抗CD20單抗后可以對細胞進(jìn)行追蹤和清除。另一種方法是利用人表皮生長(cháng)因子受體（EGFR）片段/抗-EGFR單克隆抗體，在使用特定的單克隆抗-EGFR抗體來(lái)對轉導的細胞進(jìn)行選擇，跟蹤和清除。

6.2雙靶向策略以確保安全

鑒于自殺基因的激活可清除大部分CAR-T細胞，他將有效的緩解輸注轉導的T細胞引起的副作用，而激活自殺基因僅作為最后萬(wàn)不得已的辦法。但是在臨床應用中尚未有新的方法。

有一種讓人感興趣的方法來(lái)減少CAR-T細胞治療的不良反應，就是在T細胞上修飾2種不同的CARs，每一個(gè)CAR各對應不同的TAA表位。也就是，1號CAR負責傳遞殺傷信號，2號CAR負責傳遞共刺激信號。在這個(gè)策略中，僅當兩個(gè)抗原同時(shí)表達時(shí)T細胞才能被活化和產(chǎn)生效應功能。(圖1B(i))

為避免攻擊共表達TAA的正常組織，研究者制定了一個(gè)策略即同時(shí)表達一個(gè)抑制性的CAR（iCAR）。iCARs即是加入細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）或程序性死亡-1（PD-1）信號域，盡管存在ζ鏈信號域，備用靶標可以刺激產(chǎn)生一個(gè)抑制信號，以覆蓋ζ鏈的活化信號 (圖1B(ii))。在表達"活化型"CAR識別的TAA的正常組織中，iCAR將識別其共表達的第二抗原。重要的是，在iCAR脫離后T細胞將重新獲得殺傷靶細胞的能力。Fedorov等人在臨床前模型中證實(shí)了這項策略的可行性和有效性。

另一種新的方法是"TanCAR"技術(shù) ，即靶向兩種不同的抗原但只用一個(gè)基因轉導結構。TanCAR是由柔性接頭分開(kāi)的兩個(gè)不同抗原結合結構域組成，并且兩個(gè)TAA組成的兩個(gè)結合域同時(shí)結合產(chǎn)生了協(xié)同效應(圖1B(iii))。重要的是，即使1種TAA與單結構域結合也能激活T細胞并殺滅目標。另外在臨床前模型和一項臨床試驗中，電轉導mRNA編碼CAR分子的T細胞（RNA-CAR-T-meso-cells）已被成功驗證。在電轉導一周后RNA電轉導的T細胞可檢測到CAR的表達和功能，多次注射 RNA-CAR-T-meso-cells介導了小鼠大量血管側翼間皮瘤的消退，包括植入的從患者身上分離出的間皮質(zhì)腫瘤也出現了消退。通過(guò)CAR的瞬時(shí)表達，這可能為限制嚴重不良反應提供了一個(gè)更安全的方法。在給2例患者靜脈注射后作者已證實(shí)這個(gè)途徑的安全性和可行性，1例是晚期胸膜間皮質(zhì)瘤另1例是轉移性胰腺癌，2例患者各自的原發(fā)和轉移灶腫瘤負荷降低，并且CA199指標下降。實(shí)驗室抗腫瘤活性證據發(fā)現了 RNA-CAR-T-meso cells產(chǎn)生的新型抗腫瘤抗體，揭示了引發(fā)的抗腫瘤免疫應答的機制。作為這一策略的關(guān)注點(diǎn)，為達到抗腫瘤的最佳效果，多次輸注導致了因鼠源CAR產(chǎn)生的lgE免疫應答引起的過(guò)敏反應。然而，使用人源化的scFv結構域可能會(huì )降低該風(fēng)險，以及縮短輸注產(chǎn)生免疫應答效應細胞的持續時(shí)間。

7. 異體CAR-T細胞

雖然同種異體造血干細胞移植是治療血液和淋巴系統惡性腫瘤復發(fā)高?；颊叩囊粋€(gè)潛在辦法，但需其他的對策來(lái)進(jìn)一步降低移植后復發(fā)的風(fēng)險。實(shí)現這一目標的方法之一就是在移植后預防性輸注CAR-T細胞，盡管這可能有缺乏抗原來(lái)刺激來(lái)維持輸注的CAR-T細胞的擴增和持久性的顧慮。另外，根據報道在某些情況下，在同種異體造血干細胞移植后AML復發(fā)，這是因為同種異體應激反應以致不匹配的HLA等位基因選擇性丟失，這些患者暴露在同種異體反應的可怕并發(fā)癥下，即移植物抗宿主?。℅VHD），而卻沒(méi)有從治療中獲益。因而異體CAR-T治療可以繞過(guò)腫瘤介導的免疫逃逸機制。

10例同種異體造血干細胞移植后復發(fā)的惡性淋巴瘤患者，在接受原捐獻者同種異體CD19特異性CAR-T治療后，有1例完全緩解（輸注T細胞后9個(gè)月仍在持續）并且沒(méi)有發(fā)生移植物抗宿主病，但有4例患者出現3-4級毒性。

同種異體CAR-T細胞也可能導致移植物抗宿主病，因而需要更嚴格的安全措施，自殺基因是理想的選擇，因為在未修飾的供體淋巴細胞輸注（DLI）的臨床試驗中，它是迄今為止唯一被證明是有效的安全措施。

由于激活自殺基因同時(shí)也會(huì )消除移植物抗腫瘤的效果，因此在絕對必要時(shí)才開(kāi)啟自殺基因。

除了圖1B中總結的自殺基因修飾方法之外，還要有最大限度降低移植物抗宿主病風(fēng)險的備選方案?；蛘哂肅AR修飾的天然的非同種異體的T細胞，如 allodepleted-T細胞，病毒特異性T細胞，自然殺傷T細胞或γδT細胞。其實(shí)，由于這個(gè)原因作者研究了一個(gè)策略，在小鼠的體內和體外成功地將CAR導入γδT細胞表面。

關(guān)于CAR修飾的病毒特異性T細胞（非同種異體），例如，最近的一項臨床試驗將CD19 CAR植入巨細胞病毒，腺病毒，或EB病毒抗原特異性T細胞。該試驗入組患者復發(fā)（N：6）或高風(fēng)險復發(fā)（N：2），惡性淋巴瘤接受同種異體造血干細胞移植（N：2），細胞輸注6周后評估客觀(guān)反應，2例患者在移植后疾病復發(fā)，另外2例持續完全緩解，所有患者均沒(méi)出現移植物抗宿主病。令人感興趣的是可以考慮嘗試使用供者T細胞，以基因編輯的方法敲除內源性TCR，人工制造非同種異體細胞。

8. 結論

利用自體或異體的移植物抗腫瘤效應，體現了免疫療法是治療癌癥的有力方法。這是一個(gè)激動(dòng)人心的時(shí)刻，基因療法和免疫療法伴著(zhù)業(yè)內外日益高漲的熱情，正在加速發(fā)展。在未來(lái)的幾年內將看到，是否免疫治療能踐行自身的承諾，取代或增強標準的藥物抗癌療法，并具備長(cháng)期的抗癌監視，包括在可以逃逸的部位，即使作為輔助治療也是如此。要獲益需要先克服風(fēng)險，必須進(jìn)行嚴格的臨床試驗，制定策略來(lái)減弱或消除毒性。